Molekularne techniki analizy RNA

Wstęp 7 1. Analiza northern – detekcja RNA na filtrach. Wykrywanie prekursorów rRNA u drożdży 9 Opis i cel doświadczenia 9 ĆWICZENIE 1. Izolacja całkowitego RNA z różnych organizmów oraz ocena jakościowa uzyskanego preparatu 10 Metody izolacji RNA 10 RNazy 10 Dobra praktyka laboratoryjna 11 Inhibitory RNaz 11 Przechowywanie RNA 12 Ocena jakości RNA 12 Izolacja całkowitego RNA z komórek drożdżowych 13 Literatura 14 ĆWICZENIE 2. Elektroforetyczny rozdział RNA w żelu agarozowym i ocena jakości RNA 15 Technika northern 15 Znakowanie izotopowe 15 Znakowanie nieizotopowe 15 Detekcja znaczników nieradioaktywnych 16 Elektroforeza RNA z drożdży w żelu agarozowym w warunkach denaturujących 16 Transfer kapilarny 17 ĆWICZENIE 3. Wykrywanie prekursorów rRNA u drożdży – hybrydyzacja 18 Skład buforów 18 Procedura hybrydyzacji 18 Odpłukanie nadmiaru sond 18 Wizualizacja hybrydyzacji 18 Literatura 18 2. Analiza northern – wykrywanie transkryptów CUT u drożdży 20 Wstęp 20 Co to są CUTy? 20 Funkcje CUTów 21 Literatura 21 ĆWICZENIE 4. Elektroforeza RNA w denaturującym żelu poliakrylamidowym 23 Elektroforeza RNA w 6% żelu poliakrylamidowym z 7 M mocznikiem 23 Transfer elektryczny mokry 23 ĆWICZENIE 5. Hybrydyzacja RNA na membranie z sondą radioaktywną specyficzną wobec IGS1-R, wyznakowaną metodą „random-priming” 24 3. Wykrywanie małych RNA 25 Wstęp 25 Małe interferujące RNA: miRNA i siRNA 25 Wybrane metody detekcji małych RNA (iRNA) 26 Literatura 28 ĆWICZENIE 4. Pulsacyjny RT-PCR, cz. 1 – pulsacyjna odwrotna transkrypcja 29 Materiały 29 Trawienie DNazą 29 Pulsacyjna odwrotna transkrypcja 29 ĆWICZENIE 5. Reakcja PCR – cz. 2 31 ĆWICZENIE 6. Rozdział w żelu agarozowym produktów pulsacyjnego RT-PCR 32 Przygotowanie próbek 32 4. Badanie końców cząsteczek RNA na przykładzie drożdżowych prekursorów snoRNA. Technika cRT-PCR 33 Wstęp 33 RNaza H 33 Ligacja RNA 34 Literatura 34 ĆWICZENIE 6. Trawienie RNazą H i ligacja RNA 35 Trawienie RNazą H 35 Ligacja RNA 36 ĆWICZENIE 7. Reakcja odwrotnej transkrypcji i PCR 37 Reakcja odwrotnej transkrypcji 37 PCR 37 ĆWICZENIE 8. Elektroforeza produktów PCR 38 5. PCR ilościowy: RT-qPCR 39 Wstęp 39 Formaty detekcji produktów qPCR 39 Kontrola jakości RNA 40 Analiza doświadczeń qPCR 40 Najbardziej kluczowe elementy RT-qPCR 41 Literatura 42 ĆWICZENIE 8. Projektowanie starterów do qPCR – konkurs na najlepszą parę starterów 43 Wskazówki do projektowania starterów 43 Wykonanie ćwiczenia 44 ĆWICZENIE 9. Testowanie zaprojektowanych starterów do qPCR 45 Przygotowanie starterów 45 Przygotowanie reakcji qPCR 45 ĆWICZENIE 10. Analiza reakcji qPCR 46 6. Oznaczenia aktywności enzymów biorących udział w obróbce RNA 47 Oznaczanie aktywności enzymów hydrolizy kapu 47 Struktura kapu transkryptów polimerazy RNA II 47 Hydroliza kapu 48 Badanie enzymatycznej hydrolizy kapu 49 Oznaczanie aktywności endonukleazy Rnt1 50 Endonukleazy z rodziny RNazy III 50 Rnt1 51 Biogeneza sn/snoRNA u drożdży Saccharomyces cerevisiae, rola Rnt1 52 Literatura 53 ĆWICZENIE 11. Analiza aktywności Rnt1 w ekstrakcie drożdżowym 55 Protokół 55 7. Analiza oddziaływania białka z kwasem nukleinowym: test opóźnienia migracji w żelu (EMSA) 58 Wstęp 58 Analiza EMSA 58 Terminacja transkrypcji polimerazy RNA I 59 Literatura 60 ĆWICZENIE 12. Wiązanie Reb1 do IGS1 rDNA in vitro 61 Badane warianty IGS1 rDNA S. cerevisiae 61 Wiązanie białka do DNA 61 Rozdział w natywnym żelu poliakrylamidowym 61 8. Sztuczne microRNA – amiRNA 63 Wstęp 63 Wybrane zalety amiRNA 64 Wady amiRNA 64 Literatura 64 ĆWICZENIE 13. Projektowanie amiRNA 64