ebook Elementy enzymologii i biochemii białek Urszula Guzik, Danuta Wojcieszyńska

Wydawca: Wydawnictwo Uniwersytetu Śląskiego

Rok wydania: 2015

Prezentowany skrypt jest przeznaczony dla studentów biologii, biotechnologii i innych kierunków pokrewnych, którym z założenia ma ułatwić przygotowanie do ćwiczeń, zaznajomienie się z podstawowymi metodami stosowanymi w enzymologii oraz wykonanie odpowiednich doświadczeń. Podręcznik został podzielony na trzy części, z których każda obejmuje: wstęp teoretyczny, stosowane podczas zajęć materiały i odczynniki, opis przebiegu doświadczeń oraz sposób opracowania uzyskanych wyników. Podana na zakończenie każdej części literatura źródłowa umożliwia czytelnikowi samodzielne zaplanowanie badań oraz bardziej wnikliwą analizę wyników. Skrypt zawiera informacje na temat izolacji i oczyszczania 1,2-dioksygenazy katecholowej oraz charakterystykę tego enzymu, badania kinetyki reakcji enzymatycznych, w tym wyznaczenie optymalnych warunków reakcji enzymatycznej, wyznaczenie stałych kinetycznych reakcji oraz określenie wpływu inhibitorów na przebieg reakcji enzymatycznej. Omawia również metody immobilizacji enzymów, a także wpływ immobilizacji na aktywność enzymów.

Spis treści ebooka Elementy enzymologii i biochemii białek

Spis treści

Przedmowa / 9
Wykaz stosowanych oznaczeń / 11
Zasady bezpieczeństwa i higieny pracy obowiązujące w Pracowni biochemii białek / 13

1. Izolacja i oczyszczanie enzymu / 15
1.1. Izolacja i wstępne oczyszczanie 1,2-dioksygenazy katecholowej / 15
1.1.1. WPROWADZENIE / 15
1.1.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 18
1.1.3. WYKONANIE / 19
1.1.3.1. Izolacja i wstępne oczyszczanie 1,2-dioksygenazy katecholowej szczepu Stenotrophomonas maltophilia KB2 / 19
1.1.3.2. Oznaczanie aktywności 1,2-dioksygenazy katecholowej / 21
1.1.3.3. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradforda / 22
1.1.3.3.1. Przygotowanie krzywej wzorcowej / 22
1.1.3.3.2. Oznaczenie stężenia białka w badanym materiale biologicznym / 23
1.1.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 23
1.2. Wyznaczanie mas cząsteczkowych białek metodą sączenia żelowego oraz oczyszczanie białek metodą chromatografii jonowymiennej / 24
1.2.1. WPROWADZENIE / 24
1.2.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 25
1.2.3. WYKONANIE / 26
1.2.3.1. Wyznaczenie masy cząsteczkowej 1,2-dioksygenazy katecholowej metodą sączenia żelowego / 26
1.2.3.2. Oczyszczanie 1,2-dioksygenazy katecholowej metodą chromatografii jonowymiennej / 28
1.2.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 29
1.3. Elektroforeza dwuwymiarowa 2-DE białek / 30
1.3.1. WPROWADZENIE / 30
1.3.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 32
1.3.3. WYKONANIE / 32
1.3.3.1. Przygotowanie surowej frakcji enzymatycznej do elektroforezy 2-DE / 32
1.3.3.2. Przygotowanie krzywej wzorcowej do oznaczania stężenia białka metodą Bradforda w obecności buforu do przygotowywania próbek 2-DE / 33
1.3.3.3. Rehydratacja pasków IPG / 34
1.3.3.4. Izoogniskowanie białek z zastosowaniem pasków IPG / 34
1.3.3.5. Przygotowanie pasków do drugiego kierunku SDS-PAGE i rozdział elektroforetyczny / 35
1.3.3.6. Detekcja białek w żelu poliakrylamidowym metodą z Coomassie Brillant Blue / 36
1.3.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 36
1.4. Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących / 36
1.4.1. WPROWADZENIE / 36
1.4.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 38
1.4.3. WYKONANIE / 38
1.4.3.1. Przygotowanie żelu poliakrylamidowego i rozdział białek / 38
1.4.3.2. Detekcja białek w żelu poliakrylamidowym metodą z Coomassie Brillant Blue oraz metodą srebrową / 39
1.4.4. OPRACOWANIE I DOKUMNETACJA WYNIKÓW / 40
1.5. Literatura / 40

2. Kinetyka reakcji enzymatycznej katalizowanej przez 1,2-dioksygenazę katecholową / 43
2.1. Wyznaczanie optymalnych warunków reakcji enzymatycznej / 43
2.1.1. WPROWADZENIE / 43
2.1.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 44
2.1.3. WYKONANIE / 45
2.1.3.1. Badanie wpływu temperatury na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 45
2.1.3.2. Badanie wpływu pH na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 46
2.1.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 47
2.2. Wyznaczanie stałych kinetycznych reakcji enzymatycznej / 48
2.2.1. WPROWADZENIE / 48
2.2.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 51
2.2.3. WYKONANIE / 52
2.2.3.1. Badanie wpływu stężenia substratu na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 52
2.2.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 53
2.3. Inhibicja reakcji enzymatycznych / 54
2.3.1. WPROWADZENIE / 54
2.3.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 55
2.3.3. WYKONANIE / 56
2.3.3.1. Badanie wpływu 2,4-dichlorofenolu na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 56
2.3.3.2. Badanie wpływu jonów niklu na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 57
2.3.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 58
2.4. Literatura / 59

3. Immobilizacja 1,2-dioksygenazy katecholowej / 61
3.1. Wpływ immobilizacji na aktywność 1,2-dioksygenazy katecholowej / 61
3.1.1. WPROWADZENIE / 61
3.1.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 62
3.1.3. WYKONANIE / 63
3.1.3.1. Immobilizacja 1,2-dioksygenazy katecholowej / 63
3.1.3.2. Oznaczanie stężenia białka w kulkach alginianowych / 63
3.1.3.2.1. Wyznaczenie krzywej kalibracyjnej dla oznaczania stężenia białka metodą Bradforda
w obecności KOH / 63
3.1.3.2.2. Oznaczanie stężenia białkach w kulkach alginianowych metodą Bradforda w obecności
KOH / 64
3.1.3.3. Oznaczanie aktywności immobilizowanej 1,2-dioksygenazy katecholowej / 64
3.1.3.4. Wpływ czasu przechowywania na aktywność wolnego i immobilizowanego enzymu / 65
3.1.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 66
3.2. Badanie właściwości immobilizowanego enzymu / 67
3.2.1. WPROWADZENIE / 67
3.2.2. MATERIAŁY I ODCZYNNIKI / 68
3.2.3. WYKONANIE / 69
3.2.3.1. Badanie wpływu pH na aktywność wolnej i immobilizowanej 1,2-dioksygenazy katecholowej / 69
3.2.3.2. Badanie wpływu temperatury na aktywność wolnej i immobilizowanej 1,2-dioksygenazy katecholowej / 70
3.2.3.3. Badanie wpływu jonów metali oraz związków fenolowych na aktywność wolnej i immobilizowanej 1,2-dioksygenazy katecholowej / 71
3.2.3.4. Oznaczanie stężenia białka w surowej frakcji enzymatycznej i w kulkach alginianowych / 72
3.2.4. OPRACOWANIE I DOKUMENTACJA WYNIKÓW / 73
3.3. Literatura / 74