ebook Molekularne techniki analizy RNA Praca Zbiorowa

Wydawca: Wydawnictwa Uniwersytetu Warszawskiego

Rok wydania: 2013

Prezentowane w publikacji techniki są obecnie stosowane w większości laboratoriów zajmujących się biologią molekularną, ale ciągle brak ich opisu w literaturze polskojęzycznej. Wykłady do fakultetu „Molekularne techniki analizy RNA” obejmują aktualny stan wiedzy na temat metabolizmu RNA u eukariontów oraz teorię technik pozwalających na badanie poziomu RNA w komórce, nowo syntetyzowanego transkryptu oraz badania oddziaływań białek uczestniczących w transkrypcji.

Na ćwiczeniach praktycznych studenci poznają wybrane techniki badania RNA na przykładzie organizmów modelowych: drożdży Saccharomyces cerevisiae oraz rzodkiewnika Arabidopsis thaliana.

Prezentacja metod jest ilustrowana odpowiednimi przykładami, w których studenci samodzielnie badają poszczególne rodzaje RNA, jak utajnione, niestabilne transkrypty CUT czy microRNA, i etapy ich metabolizmu. Skrypt ten zawiera zarówno wprowadzenie teoretyczne odwołujące się do najnowszych pozycji literaturowych, jak i opis wykonania poszczególnych eksperymentów.

Skrypt adresowany do osób zainteresowanych metabolizmem RNA oraz nowoczesnymi, molekularnymi technikami jego badania – studentów wszystkich kierunków Wydziału Biologii i Międzywydziałowych Indywidualnych Studiów Matematyczno-Przyrodniczych Uniwersytetu Warszawskiego.

Spis treści ebooka Molekularne techniki analizy RNA

Wstęp 7

1. Analiza northern – detekcja RNA na filtrach. Wykrywanie prekursorów rRNA u drożdży 9

Opis i cel doświadczenia 9

ĆWICZENIE 1. Izolacja całkowitego RNA z różnych organizmów oraz ocena jakościowa uzyskanego preparatu 10

Metody izolacji RNA 10
RNazy 10
Dobra praktyka laboratoryjna 11
Inhibitory RNaz 11
Przechowywanie RNA 12
Ocena jakości RNA 12
Izolacja całkowitego RNA z komórek drożdżowych 13
Literatura 14

ĆWICZENIE 2. Elektroforetyczny rozdział RNA w żelu agarozowym i ocena jakości RNA 15

Technika northern 15
Znakowanie izotopowe 15
Znakowanie nieizotopowe 15
Detekcja znaczników nieradioaktywnych 16
Elektroforeza RNA z drożdży w żelu agarozowym w warunkach denaturujących 16
Transfer kapilarny 17

ĆWICZENIE 3. Wykrywanie prekursorów rRNA u drożdży – hybrydyzacja 18

Skład buforów 18
Procedura hybrydyzacji 18
Odpłukanie nadmiaru sond 18
Wizualizacja hybrydyzacji 18
Literatura 18

2. Analiza northern – wykrywanie transkryptów CUT u drożdży 20

Wstęp 20
Co to są CUTy? 20
Funkcje CUTów 21
Literatura 21

ĆWICZENIE 4. Elektroforeza RNA w denaturującym żelu poliakrylamidowym 23

Elektroforeza RNA w 6% żelu poliakrylamidowym z 7 M mocznikiem 23
Transfer elektryczny mokry 23

ĆWICZENIE 5. Hybrydyzacja RNA na membranie z sondą radioaktywną specyficzną wobec IGS1-R, wyznakowaną metodą „random-priming” 24

3. Wykrywanie małych RNA 25

Wstęp 25
Małe interferujące RNA: miRNA i siRNA 25
Wybrane metody detekcji małych RNA (iRNA) 26
Literatura 28

ĆWICZENIE 4. Pulsacyjny RT-PCR, cz. 1 – pulsacyjna odwrotna transkrypcja 29

Materiały 29
Trawienie DNazą 29
Pulsacyjna odwrotna transkrypcja 29

ĆWICZENIE 5. Reakcja PCR – cz. 2 31
ĆWICZENIE 6. Rozdział w żelu agarozowym produktów pulsacyjnego RT-PCR 32

Przygotowanie próbek 32

4. Badanie końców cząsteczek RNA na przykładzie drożdżowych prekursorów snoRNA. Technika cRT-PCR 33

Wstęp 33
RNaza H 33
Ligacja RNA 34
Literatura 34

ĆWICZENIE 6. Trawienie RNazą H i ligacja RNA 35

Trawienie RNazą H 35
Ligacja RNA 36

ĆWICZENIE 7. Reakcja odwrotnej transkrypcji i PCR 37

Reakcja odwrotnej transkrypcji 37
PCR 37

ĆWICZENIE 8. Elektroforeza produktów PCR 38

5. PCR ilościowy: RT-qPCR 39

Wstęp 39
Formaty detekcji produktów qPCR 39
Kontrola jakości RNA 40
Analiza doświadczeń qPCR 40
Najbardziej kluczowe elementy RT-qPCR 41
Literatura 42

ĆWICZENIE 8. Projektowanie starterów do qPCR – konkurs na najlepszą parę starterów 43

Wskazówki do projektowania starterów 43
Wykonanie ćwiczenia 44

ĆWICZENIE 9. Testowanie zaprojektowanych starterów do qPCR 45

Przygotowanie starterów 45
Przygotowanie reakcji qPCR 45

ĆWICZENIE 10. Analiza reakcji qPCR 46

6. Oznaczenia aktywności enzymów biorących udział w obróbce RNA 47

Oznaczanie aktywności enzymów hydrolizy kapu 47
Struktura kapu transkryptów polimerazy RNA II 47
Hydroliza kapu 48
Badanie enzymatycznej hydrolizy kapu 49
Oznaczanie aktywności endonukleazy Rnt1 50
Endonukleazy z rodziny RNazy III 50
Rnt1 51
Biogeneza sn/snoRNA u drożdży Saccharomyces cerevisiae, rola Rnt1 52
Literatura 53

ĆWICZENIE 11. Analiza aktywności Rnt1 w ekstrakcie drożdżowym 55

Protokół 55

7. Analiza oddziaływania białka z kwasem nukleinowym: test opóźnienia migracji w żelu (EMSA) 58

Wstęp 58
Analiza EMSA 58
Terminacja transkrypcji polimerazy RNA I 59
Literatura 60

ĆWICZENIE 12. Wiązanie Reb1 do IGS1 rDNA in vitro 61

Badane warianty IGS1 rDNA S. cerevisiae 61
Wiązanie białka do DNA 61
Rozdział w natywnym żelu poliakrylamidowym 61

8. Sztuczne microRNA – amiRNA 63

Wstęp 63
Wybrane zalety amiRNA 64
Wady amiRNA 64
Literatura 64

ĆWICZENIE 13. Projektowanie amiRNA 64