Medyczne laboratorium diagnostyczne

Przedmowa 8 1. Charakterystyka analityczna metody laboratoryjnej – Bogdan Solnica 1 1.1. Wstęp 1 1.2. Granica próbki ślepej 2 1.3. Granica wykrywalności 2 1.4. Granica oznaczalności 3 1.5. Czułość funkcjonalna 4 1.6. Liniowość 4 1.7. Odporność 5 1.8. Dokładność 5 1.9. Precyzja 6 2. Metody spektroskopowe – Krystyna Sztefko 9 2.1. Wstęp 9 2.2. Promieniowanie elektromagnetyczne 9 2.3. Oddziaływanie promieniowania elektromagnetycznego z materią 10 2.4. Kryteria podziału metod spektroskopowych 12 2.4.1. Spektroskopia absorpcyjna UV-VIS 13 2.4.2. Absorpcja atomowa 13 2.4.3. Absorpcja cząsteczkowa 13 2.4.4. Chromofory 15 2.4.5. Emisja atomowa 16 2.4.6. Emisja cząsteczkowa 16 2.4.7. Spektroskopia UV-VIS w diagnostyce laboratoryjnej 16 2.5. Jądrowy rezonans magnetyczny 18 2.6. Metody spektroskopii absorpcyjnej 18 2.6.1. Metody spektrofotometryczne 19 2.6.2. Metody pomiaru światła w roztworach mętnych (turbidymetria i nefelometria) 30 2.6.3. Spektrometria atomowo-absorpcyjna 32 2.7. Metody spektroskopii emisyjnej 34 2.7.1. Fotometria płomieniowa 34 2.8. Spektroskopia luminescencji 35 2.9. Fluorescencja 35 2.9.1. Aparatura do pomiaru fluorescencji (spektrofluorymetry) 38 2.9.2. Problemy z pomiarem fluorescencji 39 2.9.3. Zastosowanie fluorymetrii w diagnostyce laboratoryjnej 39 2.10. Chemiluminescencja 40 2.10.1. Powstawanie chemiluminescencji 40 2.10.2. Aparatura do pomiaru chemiluminescencji 42 2.10.3. Zastosowanie chemiluminescencji w diagnostyce laboratoryjnej 42 2.11. Reflektometria 42 2.12. Podsumowanie 43 3. Metody elektrochemiczne – Krystyna Sztefko 45 3.1. Wstęp 45 3.2. Zasady metod elektrochemicznych 46 3.2.1. Potencjometria 46 3.2.2. Amperometria 48 3.2.3. Konduktometria 48 3.2.4. Kulometria 48 3.3. Elektrody stosowane w elektrochemii 49 3.3.1. Elektrody referencyjne (odniesienia, porównawcze) 49 3.3.2. Elektrody selektywne (wskaźnikowe, indykatorowe) 50 3.4. Elektrody selektywne dla cząsteczek 65 3.4.1. Elektroda do pomiaru ciśnienia parcjalnego dwutlenku węgla 65 3.4.2. Elektroda do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu 66 3.4.3. Elektrody wykorzystujące proces biologicznego rozpoznawania 67 3.4.4. Biosensory DNA 69 3.4.5. Biosensory immunochemiczne 71 3.5. Podsumowanie 71 4. Metody elektroforetyczne – Maria Kapusta 73 4.1. Wstęp 73 4.2. Rodzaje nośników elektroforetycznych 76 4.2.1. Żele agarozowe 77 4.2.2. Żele poliakrylamidowe 77 4.3. Techniki stosowane do rozdziału, identyfikacji i oznaczania ilości białek 78 4.3.1. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym78 4.3.2. Elektroforeza natywna 80 4.3.3. Ogniskowanie izoelektryczne 80 4.3.4. Elektroforeza dwukierunkowa 80 4.3.5. Elektrochromatografia 82 4.3.6. Elektroforeza kapilarna 83 4.4. Metody immunoelektroforetyczne 86 4.4.1. Immunoelektroforeza 86 4.4.2. Immunofiksacja 87 4.4.3. Immunoelektroforeza rakietowa według Laurella87 4.4.4. Wykrywanie białek przy użyciu metody Western blot 88 4.5. Techniki barwienia 88 4.6. Ilościowa ocena rozdziałów elektroforetycznych 89 4.7. Zastosowanie metod elektroforetycznych w diagnostyce laboratoryjnej 89 4.7.1. Rozdział elektroforetyczny białek surowicy 89 4.7.2. Rozdział elektroforetyczny białek moczu 91 4.7.3. Rozdział elektroforetyczny białek płynu mózgowo-rdzeniowego 91 4.7.4. Rozdział elektroforetyczny kwasów nukleinowych 92 5. Metody chromatograficzne – Agnieszka Kondracka, Zbigniew Bartoszewicz 95 5.1. Zasada metod chromatograficznych 95 5.1.1. Przygotowanie próbek do rozdziału chromatograficznego 96 5.1.2. Ocena jakości rozdziału chromatograficznego 98 5.1.3. Aspekty ilościowe rozdziału chromatograficznego 99 5.2. Techniki pomiarowe i aparatura 101 5.2.1. Chromatografia gazowa 101 5.2.2. Kolumnowa chromatografia cieczowa 104 5.2.3. Chromatografia cienkowarstwowa 108 5.3. Przykłady zastosowania metod chromatograficznych w diagnostyce laboratoryjnej 109 5.3.1. Profil steroidów w moczu dobowym metodą chromatografii gazowej 109 5.3.2. Analiza składników powietrza wydychanego za pomocą chromatografii gazowej 109 5.3.3. Analiza składu kwasów mykolowych metodą HPLC 110 5.3.4. Badanie wariantów hemoglobiny i oznaczanie HbA1c za pomocą analizatorów chromatograficznych 110 5.3.5. Oznaczanie amin biogennych z użyciem HPLC 111 6. Technika spektrometrii mas – Zbigniew Bartoszewicz, Agnieszka Kondracka 113 6.1. Zasada techniki spektrometrii mas 113 6.2. Techniki pomiarowe i aparatura 118 6.2.1. Typy analizatorów 118 6.2.2. Możliwości analizy związków w zależności od wybranej techniki spektrometrii mas 120 6.3. Przykłady zastosowania techniki spektrometrii mas w diagnostyce laboratoryjnej 121 6.3.1. Warunki wprowadzania techniki spektrometrii mas do rutynowych badań diagnostycznych 121 6.3.2. Zastosowania spektrometrii mas w endokrynologii 123 6.3.3. Wykrywanie wrodzonych wad metabolicznych 127 6.3.4. Zastosowania spektrometrii mas w mikrobiologii129 6.3.5. Zastosowanie spektrometrii mas w monitorowaniu stężenia leków. 131 6.3.6. Zastosowanie spektrometrii mas w toksykologii 131 6.3.7. Przyszłość spektrometrii mas w laboratorium diagnostycznym 132 7. Metody immunochemiczne – Krystyna Sztefko 135 7.1. Zasada metod immunochemicznych 135 7.2. Rodzaje metod immunochemicznych 136 7.2.1. Metody strąceniowe 136 7.2.2. Metody immunochemiczne ze znacznikiem 137 7.3. Standaryzacja i harmonizacja metod immunochemicznych 142 7.4. Techniki pomiarowe w metodach immunochemicznych 143 7.5. Zastosowanie metod immunochemicznych w diagnostyce laboratoryjnej 145 7.6. Przedanalityczne i analityczne czynniki interferujące w metodach immunochemicznych 146 7.6.1. Reakcje krzyżowe w metodach immunochemicznych 148 7.6.2. Białka wiążące jako źródło interferencji w metodach immunochemicznych 150 7.6.3. Nieimmunogenne kompleksy białek z IgG, autoprzeciwciała, przeciwciała heterofilowe i przeciwciała antyzwierzęce jako źródło interferencji w metodach immunochemicznych 152 7.7. Efekt niskiej dawki i efekt wysokiej dawki 159 7.8. Poszukiwanie i usuwanie interferujących przeciwciał 160 7.9. Uwaga końcowa 160 8. Metody analityczne w technologii suchej chemii – Krystyna Sztefko, Przemysław Tomasik 163 8.1. Wstęp 163 8.2. Techniki pomiarowe stosowane w suchej chemii 163 8.2.1. Odczyt wzrokowy 164 8.2.2. Reflektometria 165 8.2.3. Fluorymetria 168 8.2.4. Potencjometria 168 8.3. Wykorzystanie suchej chemii w diagnostyce laboratoryjnej 168 8.3.1. Testy paskowe do badania ogólnego moczu 168 8.3.2. System Vitros 172 8.3.3. Reflotron 178 8.3.4. Systemy HemoCue 179 8.3.5. Biosensory i immunosensory 180 8.3.6. Metody immunochromatograficzne bocznego przepływu 182 8.4. Zalety metod suchej chemii 184 9. Metody izotopowe – Krystyna Sztefko 187 9.1. Wstęp 187 9.2. Emitery promieniowania alfa, beta i gamma w diagnostyce laboratoryjnej 188 9.3. Prawo rozpadu promieniotwórczego 189 9.4. Aktywność preparatu promieniotwórczego i jej jednostki 190 9.5. Pomiar aktywności w laboratorium 192 9.6. Ochrona przed promieniowaniem 192 9.6.1. Dawka pochłonięta i dawka ekspozycyjna 193 9.7. Ochrona przed skutkami promieniowania 194 9.8. Rodzaje metod izotopowych 195 9.8.1. Analiza aktywacyjna 195 9.8.2. Metody radiometryczne 195 9.8.3. Rozcieńczania izotopowe 195 9.9. Izotopy w diagnostyce laboratoryjnej 199 9.9.1. Aparatura do pomiaru promieniowania 199 9.9.2. Pomiar izotopów stabilnych 199 9.9.3. Pomiar emiterów promieniowania beta 201 9.9.4. Pomiar emiterów promieniowania gamma 203 9.10. Zastosowanie metod izotopowych w diagnostyce laboratoryjnej 203 9.10.1. Metody immunochemiczne 204 9.10.2. Metody stosowane w genetyce i biologii molekularnej 204 9.10.3. Testy oddechowe 204 9.10.4. Ocena funkcji mózgu 206 9.10.5. Ocena utraty białka z przewodu pokarmowego 206 9.10.6. Metoda rozcieńczenia znacznika 206 9.10.7. Zastosowanie techniki spektrometrii mas połączonej z rozcieńczeniem izotopowym 207 10. Cytometria przepływowa – Łukasz Sędek, Bogdan Mazur 209 10.1. Wprowadzenie do techniki cytometrii przepływowej 209 10.1.1. Rozwój cytometrii przepływowej 209 10.1.2. Budowa cytometru przepływowego 210 10.1.3. Materiał do badań cytometrycznych 212 10.1.4. Zasada pomiaru cytometrycznego 212 10.1.5. Techniki barwienia materiału do analizy cytometrycznej 216 10.1.6. Podstawy zjawiska fluorescencji 218 10.1.7. Właściwości spektralne fluorochromów stosowanych w cytometrii przepływowej 219 10.1.8. Kontrola poprawności pracy cytometru 220 10.2. Zastosowania cytometrii przepływowej 221 10.2.1. Zastosowanie cytometrii przepływowej w immunologii i hematologii 222 10.2.2. Pozostałe zastosowania cytometrii przepływowej 226 10.3. Podsumowanie 230 11. Metody biologii i genetyki molekularnej – Marek Sanak 233 11.1. Wstęp 233 11.2. Kliniczne skutki mutacji 235 11.3. Rodzaje mutacji genetycznych 236 11.3.1. Mutacje punktowe 237 11.3.2. Mutacje wielonukleotydowe 238 11.4. Mutacje genomu mitochondrialnego 239 11.5. Metody wykrywania mutacji genowych 239 11.5.1. Materiał biologiczny do badania DNA 239 11.5.2. Techniki wykrywania mutacji genowych 241 11.6. Metody celowane wykrywania mutacji genowych 245 11.6.1. Klasyczne techniki hybrydyzacji DNA genomowego 245 11.6.2. Amplifikacja DNA genomowego techniką polimerazowej reakcji łańcuchowej 246 11.6.3. Badanie polimorfizmu restrykcyjnego produktów amplifikacji PCR 247 11.6.4. Badanie produktów amplifikacji PCR poprzez ich detekcję techniką hybrydyzacji 249 11.6.5. Inne celowane metody wykrywania mutacji genowej 251 11.6.6. Metody celowane wykrywania mutacji typu insercyjno-delecyjnego 252 11.6.7. Wykrywanie mutacji dynamicznych techniką PCR 255 11.7. Dostępność badań w genetycznej diagnostyce molekularnej 256 11.7.1. Metody molekularne w badaniach cytogenetycznych 256 12. Metody stosowane w badaniach hematologicznych – Bogdan Mazur 257 12.1. Historia badań hematologicznych 257 12.2. Materiał do badań hematologicznych 258 12.3. Metody badań hematologicznych 259 12.3.1. Metoda 3-diff 260 12.3.2. Metoda 5-diff 263 12.4. Wyniki badań hematologicznych 268 12.5. Standaryzacja 272 12.6. Automatyzacja w immunohematologii 274 13. Metody stosowane w badaniach hemostazy– Anna Raszeja-Specht,Jacek Golański 279 13.1. Wstęp 279 13.2. Materiał do badań układu hemostazy 279 13.3. Badania układu krzepnięcia metodami fizykochemicznymi 280 13.4. Oznaczanie liczby płytek krwi 281 13.5. Badanie reaktywności płytek krwi 282 13.5.1. Turbidymetryczny pomiar agregacji 282 13.5.2. Impedancyjny pomiar agregacji 283 13.5.3. Pomiar czasu okluzji 283 13.6. Badania z wykorzystaniem wiskozymetrycznych i/lub optycznych metod detekcji skrzepu 284 13.6.1. Czas protrombinowy (PT) 284 13.6.2. Czas częściowej tromboplastyny po aktywacji (APTT) 285 13.6.3. Fibrynogen (Fg) 286 13.6.4. Czas trombinowy (TT) 287 13.6.5. Czas reptylazowy (RT) lub czas ankrodowy 287 13.6.6. Czas ekarynowy (ECT) 288 13.6.7. Oznaczanie aktywności czynników VIII, IX i XI 288 13.6.8. Oznaczanie aktywności czynników VII, V, II i X 289 13.6.9. Wykrywanie oporności na aktywowane białko C (APC-R) 289 13.6.10. Wykrywanie przeciwciał antyfosfolipidowych: antykoagulantu tocznia (LA) i innych 290 13.7. Badania układu krzepnięcia metodami biochemicznymi z zastosowaniem substratów chromogennych 291 13.7.1. Oznaczanie aktywności antytrombiny (AT) 292 13.7.2. Oznaczanie aktywności białka C (PC) 293 13.7.3. Oznaczanie aktywności anty-Xa 293 13.8. Badania układu krzepnięcia metodami immunochemicznymi 294 13.8.1. Oznaczanie stężenia dimeru D (DD) 294 13.8.2. Antygen czynnika von Willebranda (vWF:Ag) 296 13.8.3. Wiązanie czynnika von Willebranda z kolagenem (vWF:CB) 296 13.8.4. Aktywność czynnika von Willebranda jako kofaktora rystocetyny (vWF:RCo) 297 13.8.5. Oznaczanie stężenia całkowitego (PS) i wolnego (fPS) białka S 297 13.8.6. Oznaczanie stężeń przeciwciał antykardiolipinowych (ACA) i przeciwciał przeciw β2-glikoproteinie I (β2-GPI) 298 13.8.7. Oznaczanie stężeń przeciwciał przeciw kompleksowi czynnik płytkowy 4–heparyna (anty-PF4/H) 299 13.9. Metody biologii molekularnej 299 13.10. Aparatura wykorzystywana w diagnostyce zaburzeń hemostazy 300 13.11. Analizatory POCT 301 13.12. Automatyzacja i integracja laboratoryjnej diagnostyki hemostazy 302 13.13. Kierunki rozwoju diagnostyki hemostazy 302 14. Metody stosowane w diagnostyce mikrobiologicznej – Elżbieta Stefaniuk 305 14.1. Wstęp 305 14.2. Hodowla drobnoustrojów 306 14.2.1. Hodowla bakterii i grzybów 306 14.2.2. Diagnostyka wirusologiczna oparta na hodowlach komórkowych 309 14.2.3. Systemy automatyczne do hodowli bakterii i grzybów z krwi i płynów z jam ciała 310 14.3. Metody mikroskopowe 311 14.4. Techniki barwienia 312 14.5. Identyfikacja drobnoustrojów 314 14.5.1. Klasyczne schematy identyfikacyjne drobnoustrojów 314 14.5.2. Automatyczne systemy do identyfikacji drobnoustrojów 315 14.5.3. Spektrometria mas 315 14.6. Metody serologiczne i immunochemiczne 316 14.7. Oznaczanie lekowrażliwości drobnoustrojów 318 14.7.1. Automatyczne systemy do identyfikacji i oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów 321 14.8. Metody biologii molekularnej 323 14.8.1. Molekularna diagnostyka zakażeń 324 14.8.2. Typowanie genetyczne do celów epidemiologii 327 15. Laboratoryjny system informatyczny – Barbara Kopeć, Piotr Sitkowski 335 15.1. Wstęp 335 15.2. Funkcje laboratoryjnego systemu informatycznego 337 15.2.1. Moduł „Rejestracja zleceń” 338 15.2.2. Moduł „Przyjęcie materiału do laboratorium” 339 15.2.3. Moduł „Komunikacja z analizatorami” 340 15.2.4. Moduł „Kontrola jakości” 342 15.2.5. Moduł „Autoryzacja wyniku badania” 342 15.2.6. Moduły wspomagające zarządzanie laboratorium 346 15.3. Ochrona danych medycznych i osobowych pacjentów w laboratorium 348 15.4. Koszty informatyzacji 349 16. Automatyzacja w medycznym laboratorium diagnostycznym – Bogdan Solnica 353 16.1. Wstęp 353 16.2. Automatyczne analizatory laboratoryjne. Konsolidacja badań 354 16.3. Automatyzacja fazy pozaanalitycznej 356 16.4. Częściowa i całkowita automatyzacja laboratorium 357 Skorowidz 361